Q1：计算ELISA实验结果必须用log-log 分析计算结果吗？
不是。线性回归分析，取对数后，线性回归分析，或者多项式或者4参数法分析都是可以的。ELISA结果计算，常用4参数方法。在线软件：https://www.mycurvefit.com/或本地软件：origin9.0
FAQ
常见问题合集
各产品线问题合集，快速定位实验与使用中的高频问题。
共 66 条问题
(0)
Q2：选择哪个货号？超敏，高敏和广域胰岛素试剂盒？
-根据检测胰岛素浓度范围，分为超敏，高敏和广域系列。它们的质量一样优秀，只是检测范围不同。 -在不同的实验条件下, 各种样品间的胰岛素含量可以有上千倍的差别, 目前国际上还没有一款试剂盒可以满足如此大的检测范围要求, 因此根据具体的实验情况来选择合适的试剂盒显得尤为重要, 以下建议可供参考: a) 正常小鼠或大鼠(wild type) 禁食 (fasting) 超过8小时后其胰岛素含量会较低，建议使用超敏试剂盒 (Ultrasensitive kit: 0.05 to 2 ng/ml)。 b) 小鼠或大鼠在饱食状态 (fed) 或禁食不超过6小时，建议使用高敏试剂盒 (High sensitive kit: 0.2 to 6.9 ng/ml)。 c) 在胰岛(Islet)或 β细胞分泌实验中，样品的胰岛素含量较高， 建议使用广域试剂盒 (Wide range kit: 1 to 40 ng/ml)。另外，此类实验通常会出现胰岛素含量很高的样品，使用者需要先通过预实验来确定样品的稀释倍数以取得较好的测定结果。
Q3：关于GSIS实验有哪些注意事项？
以下是我们的建议： a) 一般建议小鼠年龄12-20周。禁食时间可能过长，我们接触的研究人员做IGTT，禁食时间~8 小时，供参考。 b) 一般腹腔注射葡萄糖后，10分钟可以看到胰岛素明显上升。口服葡萄糖，时间会相应延长。 c) 尾部取血，不取第一滴，因为溶血厉害。尽量取顺流出的血样。取血动作一般在30s 内完成。避免溶血标本。分离血清后，为保证样品干净，10,000rpm再次离心2-3分钟。d) 这个实验操作较繁琐，一般需要两个人配合完成。6只老鼠，最好3个人。 e) insulin & glucose 先升高，再降低。但是Insulin 浓度维持的短，Glucose 维持时间长。建议增加取血点 5mins， 10mins。 f) High fat diet mice insulin 升高明显，有时成倍增加。但是Lean mice insulin 一般只增加20-30%。 g) 标准操作是在有水平震荡仪（600rpm）中孵育。在没有水平震荡仪的情况，请务必确保混匀sample。同时建议增加50%的孵育时间(in the first step)来增强反应信号。具体时间请参考对应货号的说明书。
Q4：用高脂饮食诱导C57小鼠，造成胰岛素抵抗模型，大概需要多少时间？胰岛素抵抗模型建成的指标是哪些？
小鼠6或8 周大起诱导8 至12 周，注射胰岛素看血糖的降幅，在打完胰导素后二十分钟取第一个血样测血糖与起点比，一般對照組血糖可降50％左右，抵抗組如果小于20％可认为成功建立。
Q5：溶血样品对胰岛素检测是否有干扰？
有干扰。特别是要避免重度溶血样品。溶血标本会造成检测数值偏低。轻度溶血干扰不大。建议：尾巴采血时，避免用力按压。针筒抽血后，应把针头去掉再把血液样品打出。
Q6：脂肪含量高的样本如何处理？
脂肪对抗原抗体的结合有干扰，所以高血脂样品对胰岛素检测有干扰。建议：4°C 高速离心，取上清。枪头尽量避免固体部分。如无法避免碰到油脂，可以重复离心。（也可以用纸巾把Tip头上的油脂轻轻擦掉，再打出样品）
Q7：可以测血浆，血清中的胰岛素浓度吗？
可以。ELISA试剂盒是测液体中的胰岛素，包括血清，血浆，组织研磨液和细胞培养上清等。
Q7：胰岛素单位如何换算？
1ng/ml *172.18=1 pmol/L 1 µIU/ml=0.0348 ng/ml
RCA 试剂盒
(1)Q1：RCA需要注意什么？
a)Phi29的热稳定性非常重要。EZassay Phi29是在原始蛋白的基础上进行酶功能定向进化改造而来的第二代产品，拥有超强扩增能力以及非常好的热稳定性。从而保证得到大量扩增产物。 b)由于phi29 DNA Polymerase具有较强的3’→5’外切酶活力，建议合成引物时对其3’端进行硫代磷酸酯键修饰，或使用高浓度的随机引物，以降低外切酶活力对引物的切割效应。
RPA 试剂盒
(22)Q1：如何设计RPA/RAA的引物？
首先最佳引物或者gRNA需要通过实验筛选得到。目前软件无法准确预测。请知悉。 对于初学者，可以利用在线软件辅助设计。在输出结果中，优先选择排序靠前的引物。建议正向引物选3~5条，反向引物选3 ~5条，然后进行实验对比，挑选最佳组合。
Q2：PCR引物能否用于RPA/RAA扩增？
可以。但效果不是最佳，使用PCR引物的话大概率会降低恒温扩增的效率和灵敏度。恒温扩增的引物一般在30-35bp。引物对于RPA/RAA的特异性与灵敏度非常重要，建议通过软件设计，然后进行实验筛选，得到最佳引物对。
Q3：可以使用PCR探针吗？
不行。
Q4：RPA/RAA目的序列的扩增长度一般是多少？
一般来说，我们建议由两个恒温扩增引物产生的扩增子通常不应超过约 500 bp。 恒温扩增产物的大小可能没有下限，但 恒温扩增引物的最小大小要求扩增子通常长于 80bp。理想的扩增子应为 100-200 个碱基对。
Q5：建议的反应温度是多少？
可以在37~42℃范围内进行反应，更高的温度会损害酶的活性，更低的温度本身是可以进行反应的，但是更低的温度会导致酶活性降低。对于RT试剂盒，我们建议在40°C下进行反应，因为逆转录酶在稍高的温度下表现更好。
Q6：恒温扩增试剂盒如何选择？
待测样本（template）是DNA，选择DNA检测试剂盒。 待测样本（template）是RNA，选择RNA检测试剂盒。 如果RNA已经逆转录成cDNA，则用DNA试剂盒。 恒温扩增试剂盒分为基础型，荧光型和试纸型。 基础型：无探针。仅完成扩增。跑DNA胶观察结果。或与CRISPR技术联用。 荧光型：含有ExoIII (外切酶III)，需要加入Exo探针，读荧光信号。 试纸型：含有Nfo (内切酶IV)，需要加入Nfo探针，试纸条观察结果。
Q7：RPA/RAA 基础型（Basic），荧光型（Exo）和试纸型（Nfo）什么区别？
-基础型，类似PCR，只是完成DNA扩增，用DNA胶观察结果或与CRISPR技术结合使用。 -荧光型（Exo），在基础型的基础上，引入荧光探针（Exo probe），类似荧光探针PCR。可以用荧光仪读荧光值。 -试纸型（Nfo），在基础型的基础上，引入试纸探针（Nfo probe），可以用层析试纸条观察结果。
Q8：RPA/RAA冻干版和液体版什么区别？如何选择？
冻干版：使用方便。总反应体积是固定的，20ul。 液体版：使用灵活。例如可调整反应体积，比如10ul，20ul或50ul。
Q9: 试纸条型与荧光型的区别是？如何选择？
试纸条和荧光型的，只是底物不同。 试纸条通量小，只有一个阴阳结果，成本高。不利于结果分析，条件优化。 荧光型的通量高，可以在荧光仪上定量分析，建议研发阶段用荧光型的，优化好条件后，直接更换试纸条型的底物即可。
Q10：阳性对照组无信号，怎么办？
PCR仪、qPCR仪需确保关闭热盖，可以提前选择关闭热盖选项后运行程序使得热盖开始降温，具体如何控制热盖温度请根据型号咨询厂家。一般PCR仪、qPCR仪打开电源后热盖会马上升温直到105℃。虽然选择了关闭热盖，但是热盖温度已经是105℃，因此需要确保热盖温度降到合适的温度，例如在50℃以下才可以把反应管放进去反应，否则热盖温度传导到底部，会把酶部分失活或全部失活。
Q11：为什么扩增进入平台期后，荧光信号会下降？
偶尔会出现荧光值下降的情况。特别是对于长时间反应，共价键断裂或荧光团与周围分子之间的非特异性反应，出现光漂白现象。
Q12：在侧流层析上检测恒温扩增产物需要稀释扩增产物吗？
需要，因为恒温扩增反应中的拥挤剂和蛋白质会干扰侧向流动条上的抗体，因此如果您没有充分稀释它们，您可能会得到非特异性结合的假阳性信号。
Q13： 阳性对照有信号，实验组无信号，怎么办？
1、试剂组分请充分混匀，加完样后需确保混匀（上下倒置甩或弹数次混匀，瞬时离心，重复3次。） 2、请最后再加Starter，把Starter加到管盖或管壁上（不要直接加到模板或试剂中），最后再一起混匀。 3、引物不合适。重新检查引物。 4、模板降解或浓度过低。高浓度模板，梯度稀释，评估引物。例如从10^8 copies/ml 稀释至10^1 copies/ml。
Q14：RPA(RAA) 恒温扩增为什么阴性对照组或无模板对照组有信号？
1.最常见的是交叉污染或气溶胶污染。尤其是第一次实验，阴性对照组没有信号，后来阴性对照有信号。或者阴性对照的信号非常强。这种情况建议用全新的试剂，换个环境做。加样顺序：先加阴性对照，然后样本，最后阳性对照。 2.如果第一次实验，阴性对照组就有信号，一般是引物/探针的特异性不佳，导致的非特异扩增。建议重新设计优化引物和探针。 3.探针浓度过高，引起非特异性切割，造成背景信号升高。（这种情况，信号一般是缓慢增加。） 收到后，建议分装保存。例如分成3～5管，避免反复使用同一管，造成交叉污染。
Q15：RPA(RAA)基础型产物怎么看结果？是否需要纯化？
可以通过跑DNA琼脂糖胶来看扩增产物。 跑胶前，建议65°C加热10分钟终止反应。可选步骤：纯化产物后再跑胶，这样条带会更干净。产物纯化可以用柱膜法，磁珠法或者乙醇沉淀法等。具体操作步骤，请参考纯化试剂盒说明书。 （RPA恒温扩增荧光型不能通过跑胶看结果，因为里面的核酸外切酶会把产物降解。）
Q16：为什么进入平台期后，荧光曲线会飙升？
反应中的聚合酶和核酸外切酶 III（Exo） 正在竞争。当反应耗尽能量时，核酸外切酶 III（Exo） 开始占据主导地位。这会导致更快的切割探针，所以荧光曲线会突然飙升。
Q17： RPA和RAA有什么不同？
RPA (重组酶聚合酶扩增，Recombinase Polymerase Amplification)与 RAA (重组酶辅助扩增，Recombinase Aided Amplification) 本质为同一技术，只是名称表述不同 ，均指重组酶等温扩增技术。
Q18：实验组有批间差异怎么办？
1、试剂组分请充分混匀，加完样后需确保混匀（上下倒置甩或弹数次混匀，瞬时离心，重复3次。） 2、请最后再加Starter，把Starter加到管盖或管壁上（不要直接加到模板或试剂中），最后再一起混匀。 3、其他组分（除Starter和Reaction buffer）混合后再加入到Reaction buffer均一性更稳定。 4、PCR仪、qPCR仪需确保关闭热盖，可以提前选择关闭热盖选项后运行程序使得热盖开始降温，具体如何控制热盖温度请根据型号咨询厂家。一般PCR仪、qPCR仪打开电源后热盖会马上升温直到105℃。虽然选择了关闭热盖，但是热盖温度已经是105℃，因此需要确保热盖温度降到合适的温度，例如在50℃以下才可以把反应管放进去反应，否则热盖温度传导到底部，会把酶部分失活或全部失活。
Q19：关于RPA恒温扩增试剂盒，如何选择？
-基础型，类似PCR，只是完成DNA扩增，用DNA胶观察结果或与CRISPR技术结合使用。: -荧光型，在基础型的基础上，引入荧光探针（Exo probe），类似荧光探针PCR。可以用荧光仪读荧光值。 -试纸型，在基础型的基础上，引入试纸探针（Nfo probe），可以用层析试纸条观察结果。 经验分享： -荧光型试剂盒，可以读荧光数值，可以量化，可以同时做多个条件，适合探索优化实验条件，筛选引物和探针。 -试纸型试剂盒，和荧光型设计原理高度相似，在荧光型的引物探针基础上，比较容易得到好用的引物组和探针。
Q20：RPA(RAA) 恒温扩增（荧光型）选择哪个荧光通道？
用FAM通道读取结果。（羧基荧光素）吸收波长492nm,发射波长518nm.
Q21：RPA(RAA) 恒温扩增（荧光型和试纸型）探针与引物重叠怎么办？
探针THF位点前的大概27-30个bp的同向序列可以与引物重叠
Q22：关于RPA 恒温扩增的灵敏度是多少？试剂盒中提供的阳性对照品的浓度是多少？
RPA/RAA，CRISPR DNA/RNA 检测试剂盒灵敏度一般最低能做到100copies/反应。 试剂盒中阳性对照参考品浓度大约10^5copies/ul
CRISPR 试剂盒
(12)Q1：crRNA，sgRNA，trancrRNA是什么意思？
sgRNA=small guide RNA crRNA= CRISPR RNA trancrRNA= trans-activating RNA sgRNA由crRNA和trancrRNA两部分组成。
Q2：如何设计crRNA？
crRNA由两部分组成。scaffold sequence （固定部分）+ target sequence（可变部分） 注：target sequence （20～23nt）与目标片段配对后激活Cas蛋白。
Q3：crRNA中为什么有T？
crRNA guide sequence 书写习惯用ATGC，是为了便于和target DNA序列比对。合成sgRNA时，默认U。
Q4：如何利用在线软件设计crRNA?
请先确定目的基因序列。如果需要扩增，目的基因序列一般是扩增产物序列。 确认后，将目的基因序列的FASTA格式粘贴在对话框内。请注意，由于服务器运算能力有限，目的序列的长度不宜过长。一般200~300bp即可。
Q5：如何保存crRNA？
因为RNA酶在自然环境中普遍存在，所以RNA非常容易降解。一般涉及RNA的操作，尽量用RNA酶free的耗材，戴口罩，戴手套等等。在此基础上，建议使用RNA酶抑制剂（Murine RNase inhibitor, 货号：MRI-10000）。有效抑制RNA酶活性。降低RNA降解的风险。
Q6：如何得到crRNA?
-若crRNA长度在100nt以内，建议直接选择化学合成。 -若crRNA长度大于100nt，建议用CRISPR guide RNA体外转录试剂盒。（货号：SG-RNA-001）
Q7：如何使用CRISPR DNA/RNA检测试剂盒？
以CRISPR-Cas12a DNA检测试剂盒为例，它包含两部分，恒温扩增+CRISPR-Cas12蛋白切割。第一步，恒温扩增比较关键。这步需要筛选最佳的RPA引物。可以用恒温扩增试剂盒（BA-LYO-96）筛选引物。跑DNA胶，有明显条带。得到高效引物后，再用CRISPR Cas12a DNA 试剂盒。
Q8：一步法和二步法什么区别？
一步法就是在一个管完成所有反应。（RPA扩增+CRISPR-Cas切割反应）避免开盖，降低交叉污染的风险。灵敏度相较于二步法会低1~2个数量级。 二步法是指RPA扩增与CRISPR-Cas切割反应分两步进行。研发阶段，推荐二步法，便于结果分析与条件优化。
Q9：选择CRISPR Cas12a还是CRISPR Cas13a试剂盒？
Cas12a 简单一些。扩增产物直接激活Cas12a. 不像Cas13a，需要将产物转录成RNA，才能激活Cas13a.
Q10：如何提高CRISPR DNA/RNA试剂盒灵敏度和特异性？
建议从以下几个方面优化：1.RPA引物；2.crRNA；3.reporter浓度。
Q11：CRISPR DNA/RNA试剂盒中是否包含报告分子（reporter）？
已包含带有FAM标记的报告分子 (reporter）。FAM :羧基荧光素。吸收波长 492nm 发射波长 518nm。可以用荧光仪读荧光值，例如荧光PCR仪，选FAM通道。
Q12：CRISPR Cas13a DNA/RNA检测试剂盒为什么扩增引物上要加T7启动子？
因为恒温扩增的产物是DNA。但Cas13a只能被RNA激活。引物上增加T7启动子，目的是在T7 RNA聚合酶的作用下转录得到RNA，从而激活Cas13a.
支原体检测
(4)Q1：为什么检测支原体有信号，而内参没有信号？
阳性样本信号过强（Ct值低），抑制了VIC的信号。 建议减少模板量，例如稀释10倍或100倍，VIC通道会有信号。
Q2：为什么支原体清除剂使用后，过一段时间，支原体检测复阳？
使用支原体清除剂后，支原体减少，说明清除剂有效。 培养一段时间，复阳的可能性： a) 细胞中仍然有支原体，只是处于低浓度。建议增加清除剂培养周期，例如2-3周。彻底清除支原体。 b) 培养环境，移液器或者培养基中含有支原体污染源。对于短周期的细胞实验，建议培养基中加入支原体预防剂，进行细胞培养。（2-3个月）注意：不建议培养基中长期添加支原体预防剂。容易导致支原体产生抗性。 c) 污染太严重。建议可以稀释细胞培养液，尝试增加支原体清除剂的浓度，但是要注意观察细胞状况，避免支原体清除剂浓度过高细胞毒性过大。
Q3：支原体清除剂是否会造成细胞死亡？
有3-5%左右的细胞可能会在杀灭支原体的过程中死亡。处理过程中，注意每天观察细胞的状况，由于不同细胞对本品的耐受强度不同(大多数情况下，对细胞毒性很小)，使用过程中如果该产品对细胞表现出毒性或细胞生长变慢，可以按1:2000稀释后使用。或者可以加大培养液中的血清浓度或者提高细胞的密度。
Q4：支原体检测试纸，观察到微弱条带，该如何判断？
这种情况，一般代表有支原体污染。保险起见，请浓缩您的样品：使用较大体积的上清液浓缩支原体，再进行检测。 或在使用支原体检测试剂盒重新测试之前，继续培养 48 小时。
酶原料
(2)Q1：T7 启动子后面多几个碱基是否有影响？
没有影响。一般习惯性多2~3个G。
Q2：如何保存？
收到后，建议分装包装。例如将蛋白酶分成3～5管，避免反复冻融。根据用量来稀释。稀释后的蛋白不宜长期保存。
LAMP 试剂盒
(17)Q1：Bst2.0 与Bst3.0如何选择？
-模板是DNA，建议Bst2.0 -模板是RNA，建议Bst3.0 或 Bst2.0+耐高温逆转录酶。
Q2：LAMP/RT-LAMP最大反应温度是多少？
初始实验温度建议设置为65℃；后续可以在60-70℃进行调节，具体性能取决于引物组和模板的性能。
Q3：反应液中的Mg2+浓度为多少？
2X反应液中含有16mM Mg2+，因此反应中终浓度含有8mM Mg2+。
Q4：LAMP/RT-LAMP反应时间为多久？
扩增因多种因素而异，包括引物设计、模板纯度及模板浓度。我们建议最初反应时间设置为40分钟；后期根据反应情况将反应时间在20-60分钟内调节。
Q5：反应液解冻后管内有一些沉淀正常吗？
正常。冷冻解冻后反应液中含有沉淀是正常的，通过涡旋可以溶解沉淀物；且反应时，必须待沉淀完全溶解后再添加反应液，否则会影响反应。
Q6：如何设计LAMP引物？
手动设计LAMP引物较难，建议使用软件设计，推荐网址：https://lamp.neb.com/#!/。不同引物之间的性能差异较大，建议最初设计2-4套引物，选取最佳灵敏度和特异性的引物。 引物设计怎么样设计，有哪些注意事项，可参考链接https://ezassay.com/newsinfo/news/62
Q7：等温孵育后，NTC样本发生了扩增是为什么？
1. 引物特异性不足，建议重新筛选引物进行扩增。 2. 实验室污染，建议加样区与反应区分开操作；或更换试剂且使用核酸去除剂清理试剂储存及工作空间。
Q8：等温孵育后，PC样本未发生扩增是为什么？
1. 建议添加Positive Control对照实验，若PC对照也未扩增，则为试剂性能问题，建议找客服重新发送试剂；若PC对照扩增正常，则为以下几种情况。 2. 引物性能不足，建议重新筛选引物进行扩增。 3. PC样本浓度不足，建议使用不同浓度梯度进行检测。 4. PC样本中含有干扰性杂质，建议纯化样本后进行检测。
Q9：LAMP可以使用哪些检测方法？
浊度、荧光、目视法/比色法、跑胶法等。易致生物均有对应的试剂盒。
Q10：RT-LAMP是否需要单独的孵育步骤？
不需要。因为反应体系中含有的逆转录酶在65℃即可生成cDNA。
Q11：LAMP目视法/比色法反应液的稳定性怎么样？
1. 反应液含有低浓度的Tris HCL，长时间暴露在空气中会吸附CO2导致试剂酸化，影响检测准确性，建议-20℃保存； 2. 多次使用或长时间暴露在空气中后，混合物在扩增前为深紫色则不影响反应，若变为浅橙色或黄色，则该试剂不能使用；如果将试剂分装在8联管、PCR管等类似管内，建议在2天内使用完毕。
Q12：加入LAMP目视法/比色法的模板和引物应该怎么稀释？
建议使用ddH2O稀释，不能使用Tris-HCL、PBS、TE Buffer等缓冲体系溶解或稀释。
Q13：可以使用分光光度计检测LAMP目视法/比色法反应的颜色变化吗？
可以。通过423/560nM的吸光度比值，可以实时检测反应。
Q14：LAMP目视法/比色法等温扩增后，PC样本没有发生颜色反应是什么原因？
1. 建议添加Positive Control对照实验，若PC对照也未扩增，则为试剂性能问题，建议找客服重新发送试剂；若PC对照扩增正常，则为以下几种情况； 2. 引物性能不足，建议重新筛选引物进行扩增； 3. PC样本浓度不足，建议使用不同浓度梯度进行检测； 4. PC样本中含有干扰性杂质，建议纯化样本后进行检测； PC样本使用含有缓冲体系的溶液溶解或稀释，建议建议使用ddH2O稀释，不能使用Tris-HCL、PBS、TE Buffer等缓冲体系溶解或稀释。
Q15：LAMP-CRISPR试剂盒反应是否需要开盖？
不需要。
Q16：LAMP探针怎么设计？
详情请参考LAMP恒温扩增试剂盒（RNase H2探针法）说明书。
Q17：如果反应出现污染怎么办？
1. 更换反应区域，使用核酸去除剂清理试剂储存及工作空间。 2. 采用防污染体系反应试剂盒，易致生物有全套防污染策略。