STEP 1
粘贴目标 DNA 序列或实际扩增产物。支持纯序列与单条 FASTA，只识别 A/T/C/G，长度需在 36–1000 nt 之间。
核酸检测设计
gDNA Designer
输入一条目标 DNA 或扩增产物，选择 Ago 酶种，系统会按切点关系组合出完整的检测方案：gDNA1、gDNA2、gDNA3 和 Reporter DNA。
gDNA Designer 是什么
一个面向 Argonaute（PfAgo）核酸检测的引导链设计工具：输入一段目标 DNA 或实际扩增产物，自动生成一整套可直接合成的检测序列——gDNA1、gDNA2、gDNA3 与 Reporter DNA。
PfAgo 检测体系不是单条引导链就能工作的。它需要两条引导链在目标链上切出一段特定的片段（gDNA4），再由第三条引导链在这段片段所在区间内切割，最终由 Reporter DNA 产生可读出的信号。四条序列之间靠切点坐标互相约束，任何一条改动都会影响其余几条。
手工设计这套级联关系很容易出错：既要同时满足长度、GC、同聚物、回文等一系列约束，又要保证三个切点的相对位置正确。gDNA Designer 把这些规则固化下来，一次输入直接给出整套方案并按综合评分排序。
每套方案都附带完整坐标（结合区间、切点位置、结合链），并用示意图把级联关系画出来，方便你在下单合成之前先核对一遍设计是否合理。
整套输出
一次返回 gDNA1 / gDNA2 / gDNA3 / Reporter 四条序列，不需要自己拼装。
坐标可核对
每条序列都给出结合区间、结合链与切点位置，可与示意图逐一对照。
规则内置
长度、GC、同聚物、回文、引物避让等约束由引擎统一把关。
按方案排序
按整套级联的综合评分排序，直接从排名靠前的方案开始验证。
如何使用
STEP 2
确认酶种。当前引擎只实现了 PfAgo，页面固定按 PfAgo 计算，无需选择；TtAgo 尚未开放。
STEP 3
如果已经有扩增引物，把正向/反向引物一并填入。引物不参与设计，只用于避让引物区域并提示互补风险。
STEP 4
设置返回方案数（1–20，本页默认 20），提交后在结果页逐个查看方案，并用示意图核对切点关系。
参数与规则说明
输入参数
目标序列
必填。目标 DNA 或实际扩增产物，只接受 A/T/C/G，长度 36–1000 nt。支持纯序列或单条 FASTA（标题行会被忽略）。
酶种
当前只支持 PFAGO，页面已固定提交该值；其余取值会被服务端拒绝。
正向 / 反向引物
选填。仅用于避开引物覆盖的区域，并在引导链与引物存在互补风险时给出提示，本身不是设计对象。
返回方案数
范围 1–20，本页默认取 20。按整套级联的综合评分从高到低返回。
筛选规则
引导链长度
按 16、17、15、18 的优先级尝试；gDNA4 片段长度取 16、17、18。
GC 含量
硬性过滤，落在 40%–80% 区间之外的候选直接淘汰。
同聚物
不允许出现连续 GGGG；A、C、T 任一碱基连续 5 个及以上同样淘汰。
回文
整条引导链不允许自身反向互补。
首尾互补
首尾各 5 nt 的反向互补先做严格过滤；严格模式下完全无解时才放宽重试。
输出字段
gDNA1 / gDNA2
在同一条链上切出两个切点，这两个切点之间的片段即为 gDNA4。
gDNA3
在另一条链上切割，切点需落在 gDNA4 区间内；落点是否精确由 gdna3_match_mode 标注。
Reporter DNA
gDNA4 的反向互补，用于产生可读出的信号。
坐标口径
接口返回 0-based 半开区间，页面上统一换算成 1-based 闭区间展示，并把互补链编号的坐标折算回参考链。
输入参数
目标序列
必填。目标 DNA 或实际扩增产物，只接受 A/T/C/G，长度 36–1000 nt。支持纯序列或单条 FASTA（标题行会被忽略）。
酶种
当前只支持 PFAGO，页面已固定提交该值；其余取值会被服务端拒绝。
正向 / 反向引物
选填。仅用于避开引物覆盖的区域，并在引导链与引物存在互补风险时给出提示，本身不是设计对象。
返回方案数
范围 1–20，本页默认取 20。按整套级联的综合评分从高到低返回。
输出字段
gDNA1 / gDNA2
在同一条链上切出两个切点，这两个切点之间的片段即为 gDNA4。
gDNA3
在另一条链上切割，切点需落在 gDNA4 区间内；落点是否精确由 gdna3_match_mode 标注。
Reporter DNA
gDNA4 的反向互补，用于产生可读出的信号。
坐标口径
接口返回 0-based 半开区间，页面上统一换算成 1-based 闭区间展示，并把互补链编号的坐标折算回参考链。
筛选规则
引导链长度
按 16、17、15、18 的优先级尝试；gDNA4 片段长度取 16、17、18。
GC 含量
硬性过滤，落在 40%–80% 区间之外的候选直接淘汰。
同聚物
不允许出现连续 GGGG；A、C、T 任一碱基连续 5 个及以上同样淘汰。
回文
整条引导链不允许自身反向互补。
首尾互补
首尾各 5 nt 的反向互补先做严格过滤；严格模式下完全无解时才放宽重试。
设计原理
STEP 1
归一化输入
01去掉 FASTA 标题行与全部空白字符，统一转成大写。
02校验字符集与长度：只允许 A/T/C/G，长度需落在 36–1000 nt。
03如果提供了引物，标记出引物覆盖的区域，后续候选会避开这些位置。
STEP 2
建立候选池
01按酶种预设的长度优先级在目标序列上滑窗，逐一取出候选引导链。
02对每条候选做硬性过滤：GC 区间、连续 GGGG、A/C/T 长同聚物、整条回文。
03记录每条候选的结合区间、结合链与切点位置——后面组装级联全靠这几个坐标。
STEP 3
组装级联
01枚举可能的 gDNA4 区间（长度取 16–18），它决定了最终 Reporter 的序列。
02在候选池里找出切点正好落在 gDNA4 两端的两条引导链，作为 gDNA1 与 gDNA2。
03再在对面那条链上找出切点落进 gDNA4 区间的引导链，作为 gDNA3。
STEP 4
评分与排序
01Reporter 取 gDNA4 的反向互补，至此四条交付序列全部确定。
02对整套级联综合打分，而不是只看单条引导链的好坏。
03按总分从高到低返回，并标注 gDNA3 切点与 gDNA4 区间的匹配方式。
常见问题
为什么需要三条引导链？
PfAgo 检测依赖一段被精确切下的目标片段。gDNA1 与 gDNA2 负责在同一条链上切出两个切点，界定出 gDNA4；gDNA3 则在另一条链上、gDNA4 区间内切割。三者缺一，级联就无法完成。
gDNA4 需要合成吗？
不需要。gDNA4 是被切割释放出来的目标片段，不是交付序列。它的作用是解释 Reporter 的来源——Reporter 就是 gDNA4 的反向互补。真正需要合成的是 gDNA1、gDNA2、gDNA3 和 Reporter DNA。
目标序列该放扩增产物还是原始基因序列？
建议直接放实际扩增产物。设计结果的坐标是相对于你输入的这条序列的，用扩增产物可以保证引导链落在真实存在的区域内，也便于配合引物避让功能。
填引物有什么用？
引物本身不参与设计。填入后引擎会避开引物覆盖的区域，并在引导链与引物之间存在互补风险时给出提示，减少后续实验中的非特异干扰。
为什么有时候一条方案都出不来？
通常是目标区域太短或碱基组成太极端。GC 必须落在 40%–80%，且不能出现 GGGG 或 A/C/T 的长同聚物，整条引导链也不能自身回文。可以换一段目标区域，或适当扩大输入范围再试。
结果里的坐标怎么读？
接口返回的是 0-based 半开区间，页面上已统一换算成 1-based 闭区间显示。gDNA3 一类按互补链编号给出的坐标，也已经折算回参考链坐标系，所以四条序列的区间可以直接横向比较。
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