干货！RPA(RAA)常见问题答疑（一）

Q1：阳性对照组无信号，怎么办？

PCR仪、qPCR仪需确保关闭热盖，可以提前选择关闭热盖选项后运行程序使得热盖开始降温，具体如何控制热盖温度请根据型号咨询厂家。一般PCR仪、qPCR仪打开电源后热盖会马上升温直到105℃。虽然选择了关闭热盖，但是热盖温度已经是105℃，因此需要确保热盖温度降到合适的温度，例如在50℃以下才可以把反应管放进去反应，否则热盖温度传导到底部，会把酶部分失活或全部失活。

Q2: 阳性对照有信号，实验组无信号，怎么办？

1）试剂组分请充分混匀，加完样后需确保混匀（上下倒置甩或弹数次混匀，瞬时离心，重复3次。）

2）请最后再加Starter，把Starter加到管盖或管壁上（不要直接加到模板或试剂中），最后再一起混匀。

3）引物不合适。重新检查引物。

4）模板降解或浓度过低。高浓度模板，梯度稀释，评估引物。例如从10^8 copies/ml 稀释至10^1 copies/ml。

Q3：RPA(RAA) 恒温扩增为什么阴性对照组或无模板对照组有信号？

1）最常见的是交叉污染或气溶胶污染。尤其是第一次实验，阴性对照组没有信号，后来阴性对照有信号。或者阴性对照的信号非常强。这种情况建议用全新的试剂，换个环境做。加样顺序：先加阴性对照，然后样本，最后阳性对照。

2）如果第一次实验，阴性对照组就有信号，一般是引物/探针的特异性不佳，导致的非特异扩增。建议重新设计优化引物和探针。.探针浓度过高，引起非特异性切割，造成背景信号升高。（这种情况，信号一般是缓慢增加。）

3）试剂收到后，建议分装保存。例如分成3～5管，避免反复使用同一管，造成交叉污染。

Q4：怎么设计引物？

1）我们官网有免费的在线设计软件。请先确定目的基因序列。确认后，将DNA序列的FASTA格式粘贴在对话框内。请注意，由于服务器运算能力有限，目的序列的长度不宜过长。一般200~300bp即可。

2）网页输出的结果，是不同的正向引物与反向引物组合。保持正向引物不变，反向引物可以有多个选择。每一种搭配，代表一种组合。反之亦然，保持反向引物不变，正向引物也可以有多个选择。下载Excel表格，从上往下选，正向引物选3~5条，反向引物选3~5条，进行第一轮筛选，挑选最佳组合。

3）请注意:最佳引物需要通过实验筛选得到。目前软件无法准确预测，请知悉。

Q5：RPA(RAA)基础型产物怎么看结果？是否需要纯化？

可以通过跑DNA琼脂糖胶来看扩增产物。

跑胶前，建议65°C加热10分钟终止反应。可选步骤：纯化产物后再跑胶，这样条带会更干净。产物纯化可以用柱膜法，磁珠法或者乙醇沉淀法等。具体操作步骤，请参考纯化试剂盒说明书。 （RPA恒温扩增荧光型不能通过跑胶看结果，因为里面的核酸外切酶会把产物降解）。

Q6：选择冻干版还是液体版呢？

“冻干版”：使用方便。总反应体积是固定的，20ul。

“液体版”：使用灵活。例如可调整反应体积，比如10ul，20ul或50ul。

Q7：为什么进入平台期，荧光曲线会下降？

长时间反应，会有这种情况。由于共价键断裂或荧光团与周围分子之间的非特异性反应，出现光漂白现象。

Q8：为什么进入平台期后，荧光曲线会飙升？

反应中的聚合酶和核酸外切酶III（Exo） 正在竞争。当反应耗尽能量时，核酸外切酶 III（Exo） 开始占据主导地位。这会导致更快的切割探针，所以荧光曲线会突然飙升。

Q9：能不能用PCR引物做RPA？

可以。但两者扩增原理不同，PCR验证的引物，在RPA上表现未知，效果不是最佳。引物对于RPA的特异性与灵敏度非常重要，建议通过软件设计，然后进行RPA恒温扩增试剂盒来筛选引物和探针，得到最佳引物对。

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