LAMP常见问题答疑

Q1：LAMP/RT-LAMP最大反应温度是多少？

初始实验温度建议设置为65℃；后续可以在60-70℃进行调节，具体性能取决于引物组和模板的性能。

Q2: 反应液中的Mg²⁺浓度为多少？

2X反应液中含有16mM Mg²⁺，因此反应中终浓度含有8mM Mg²⁺。

Q3：LAMP/RT-LAMP反应时间为多久？

扩增因多种因素而异，包括引物设计、模板纯度及模板浓度。我们建议最初反应时间设置为40分钟；后期根据情况将反应时间在20-60分钟内调节。

Q4：反应液解冻后管内有一些沉淀正常吗？

正常。冷冻解冻后反应液中含有沉淀是正常的，通过涡旋可以溶解沉淀物；且反应时，必须待沉淀完全溶解后再添加反应液，否则会影响反应。

Q5：如何设计LAMP引物？

手动设计LAMP引物较难，建议使用软件设计，推荐网址：https://lamp.neb.com/#!/。不同引物之间的性能差异较大，建议最初设计2-4套引物，选取最佳灵敏度和特异性的引物。

Q6：等温孵育后，NTC样本发生了扩增是为什么？

1）引物特异性不足，建议重新筛选引物进行扩增；

2）实验室污染，建议加样区与反应区分开操作；或更换试剂且使用核酸去除剂清理试剂储存及工作空间。

Q7：等温孵育后，PC样本未发生扩增是为什么？

建议添加Positive Control对照实验，若PC对照也未扩增，则为试剂性能问题，建议找客服重新发送试剂；若PC对照扩增正常，则为以下几种情况；

1)引物性能不足，建议重新筛选引物进行扩增；

2)3PC样本浓度不足，建议使用不同浓度梯度进行检测；

2)PC样本中含有干扰性杂质，建议纯化样本后进行检测。

Q8：LAMP可以使用哪些检测方法？

浊度、荧光、目视法/比色法、跑胶法等。易致生物均有对应的试剂盒。

Q9：RT-LAMP是否需要单独的孵育步骤？

不需要。因为反应体系中含有的逆转录酶在65℃即可生成cDNA。

Q10：LAMP目视法/比色法反应液的稳定性怎么样？

1)反应液含有低浓度的Tris HCL，长时间暴露在空气中会吸附CO₂导致试剂酸化，影响检测准确性，建议-20℃保存；

2)多次使用或长时间暴露在空气中后，混合物在扩增前为深紫色则不影响反应，若变为浅橙色或黄色，则该试剂不能使用；如果将试剂分装在8联管、PCR管等类似管内，建议在2天内使用完毕。

Q11：加入LAMP目视法/比色法的模板和引物应该怎么稀释？

建议使用ddH₂O稀释，不能使用Tris-HCL、PBS、TE Buffer等缓冲体系溶解或稀释。

Q12：可以使用分光光度计检测LAMP目视法/比色法反应的颜色变化吗？

可以。通过423/560nM的吸光度比值，可以实时检测反应。

Q13：LAMP目视法/比色法等温扩增后，PC样本没有发生颜色反应是什么原因？

建议添加Positive Control对照实验，若PC对照也未扩增，则为试剂性能问题，建议找客服重新发送试剂；若PC对照扩增正常，则为以下几种情况；

1)引物性能不足，建议重新筛选引物进行扩增；

2)PC样本浓度不足，建议使用不同浓度梯度进行检测；

3)PC样本中含有干扰性杂质，建议纯化样本后进行检测；

4)PC样本使用含有缓冲体系的溶液溶解或稀释，建议建议使用ddH₂O稀释，不能使用Tris-HCL、PBS、TE Buffer等缓冲体系溶解或稀释。

Q14：LAMP-CRISPR试剂盒反应是否需要开盖？

不需要。

Q15：LAMP探针怎么设计？

详情请参考LAMP恒温扩增试剂盒（RNase H2探针法）说明书。

Q16：如果反应出现污染怎么办？

1)更换反应区域，使用核酸去除剂清理试剂储存及工作空间；

2)采用防污染体系反应试剂盒，易致生物有全套防污染策略。

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