干货！RPA(RAA)常见问题答疑（二）

Q1：实验组有批间差异怎么办？

1）试剂组分请充分混匀，加完样后需确保混匀（上下倒置甩或弹数次混匀，瞬时离心，重复3次）。

2）请最后再加Starter，把Starter加到管盖或管壁上（不要直接加到模板或试剂中），最后再一起混匀。

3）其他组分（除Starter和Reaction buffer）混合后再加入到Reaction buffer均一性更稳定。

4）PCR仪、qPCR仪需确保关闭热盖，可以提前选择关闭热盖选项后运行程序使得热盖开始降温，具体如何控制热盖温度请根据型号咨询厂家。一般PCR仪、qPCR仪打开电源后热盖会马上升温直到105℃。虽然选择了关闭热盖，但是热盖温度已经是105℃，因此需要确保热盖温度降到合适的温度，例如在50℃以下才可以把反应管放进去反应，否则热盖温度传导到底部，会把酶部分失活或全部失活。

Q2：关于RPA恒温扩增试剂盒，如何选择？

1. 1. 基础型，类似PCR，只是完成DNA扩增，用DNA胶观察结果或与CRISPR技术结合使用。
   2. 荧光型，在基础型的基础上，引入荧光探针（Exo probe），类似荧光探针PCR。可以用荧光仪读荧光值。
   3. 试纸型，在基础型的基础上，引入试纸探针（Nfo probe），可以用层析试纸条观察结果。

经验分享：

• • 荧光型试剂盒，可以读荧光数值，可以量化，可以同时做多个条件，适合探索优化实验条件，筛选引物和探针。
  • 试纸型试剂盒，和荧光型设计原理高度相似，在荧光型的引物探针基础上，比较容易得到好用的引物组和探针。

Q3：RPA(RAA) 恒温扩增（荧光型）选择哪个荧光通道？

用FAM通道读取结果。（羧基荧光素）吸收波长492nm,发射波长518nm。

Q4：RPA(RAA) 恒温扩增（荧光型和试纸型）探针与引物重叠怎么办？

探针THF位点前的大概27-30个bp的同向序列可以与引物重叠。

Q5：关于RPA 恒温扩增的灵敏度是多少？试剂盒中提供的阳性对照品的浓度是多少？

RPA/RAA，CRISPR DNA/RNA 检测试剂盒灵敏度一般最低能做到100copies/反应。

试剂盒中阳性对照参考品浓度大约10^5copies/ul。

Q6： RPA和RAA有什么不同？

RPA（重组酶聚合酶扩增，Recombinase Polymerase Amplification)与 RAA (重组酶辅助扩增，Recombinase Aided Amplification) 本质为同一技术，只是名称表述不同 ，均指重组酶等温扩增技术。

结语：

这些 RPA (RAA) 实验问题解法，希望能切实为您的科研实验助力～ 科研探索路上，交流与碰撞总能催生新思路。

如果后续实操中还遇到新的状况，欢迎随时扫码联系客服聊聊；《RPA (RAA) 常见问题答疑》系列也会持续更新，收集更多大家在实验中遇到的痛点难点。

期待您的反馈，让我们一起在科研路上少走弯路，顺畅推进每一步实验，下次干货再见～

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