2025-10-23
易致生物RPA/RAA引物和探针设计
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易致生物RPA/RAA引物和探针设计
1、 Input sequence
① 输入FASTA格式序列到文本框（序列长度约80bp~1000bp，输入序列越长，服务器运算时间越长）
② 如无特别要求（仅输出31bp长度引物），按下方Find targets即可。
2、Options
①如无特别要求（仅输出31bp长度引物，不输出探针）默认选项即可。
②如需输出荧光型（EXO）或试纸型（NFO）探针，在探针类型文本框中对应选项选中即可。
③如需自定义引物长度，在引物长度输入文本框中输入相应引物长度即可。（推荐31~33bp， 输入格式为31-33）
④如需自定义探针长度，在探针长度输入文本框中输入相应探针长度即可。（推荐45~50bp， 输入格式为31-33）
⑤如需自定义扩增产物长度，在探针长度输入文本框中输入相应探针长度即可。（推荐45~50bp， 输入格式为45-50）
3、结果输出
①选取网站输出靠前面的5~10条Forward primer（FP）正向引物（输出结果可能少于10条，注意重复的引物无需重复合成），选取与Forward primer（FP）正向引物相对应的Reverse primer（RP）5~10条（选取网站输出靠前面的引物）。有设计探针的选择相应的探针。
②若需测试更多引物请点击Download full results下载结果,然后解压缩文件，打开含有Output_Sets字样的表格，选取FP GC%、RP GC%和Max Dimerisation Percentage Score较低的引物，选取不同位置的引物，同时Amplicon Size扩增产物大小合适的引物合成测试。
恒温扩增基础引物设计原则：
1、 长度：30-35bp左右；
2、 引物的5’端前3-5个核苷酸避免连续的G碱基，但是如果是C碱基或是T碱基则对扩增有好处，引物这会有利于重组酶跟引物形成filament结构；
3、 引物的3’末端的最后三个碱基，有G碱基和C碱基是有利于扩增的，可能是因为有利于聚合酶的锚定作用使得酶和引物结合得更加稳定；
4、 GC含量应大于30%和小于70%；
5、 还有就是一般引物的设计原则：
1） 应避免连续出现4个以上的单一碱基；
2） 不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构；
3） 两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；
4） 3’末端：如果可能的话，每个引物的3’末端碱基应为G或C，但不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在GC富集序列区错误引发。
6、 扩增子的长度不应超过500bp，最好是150-250bp左右。
7、 引物筛选过程举例：
1) 进行第一轮引物筛选，先选定正向F3引物去筛选所有的反向引物，得到最优的结果为F3+R4，确定R4为最优的反向引物；
2) 进行第二轮引物筛选，将R4作为最优的反向引物去对所有的正向引物进行筛选，得到最优的结果为：F4+R4。
8、 引物筛选的时候应该以比较“困难的反应条件”去筛选，比如模板浓度低和反应时间短。
9、引物的浓度可在150nM-600nM之间进行优化。
10、引物筛选可直接使用琼脂糖凝胶观察是否能扩增出目的片段。
注：可使用荧光型试剂盒筛选引物，效率更高，更直观。若要继续提高引物灵敏度，可在筛选出较优引物组例如F4R4的引物组后再逐步增减F4和R4的3’端碱基进一步筛选优化。
恒温扩增-Nfo原理图：
利用“双抗体夹心”的原理，可将恒温扩增-Nfo反应产物直接在胶体金试纸条上检测是否有反应产物。
Nfo探针示例图：
恒温扩增-Nfo探针设计原则：
1、 恒温扩增-Nfo探针结构：
恒温扩增-Nfo探针通常含有核苷酸类似物THF(四氢呋喃)、5’端荧光基团（FAM、FITC等）、3’端Block（合适的3’-修饰基团(例如C3-spacer,aphosphate, a Biotin-TEG or an amine）组成。THF(四氢呋喃)替代了目标序列中的碱基，而不是附加插入序列中。
2、 恒温扩增-Nfo反向引物结构：5’端需要进行生物素修饰；
3、 探针长度：46-52bp左右；
4、 探针的5’端距离THF≥ 27-30bp；
5、 探针的3’端距离THF≥15bp；
6、 请注意Nfo探针的3’-block不能用生物素进行block！
7、 避免探针和引物形成二聚体。
8、 同一方向的引物可以与探针重叠，重叠部分小于20nt。
9、 探针的浓度可在50nM-150nM之间进行优化；
10、探针设计可以在上述引物筛选之后确定好扩增区域后再进行设计和筛选，探针设计在上下游引物之间即可；
11、恒温扩增试剂盒（试纸型）须用相应的试纸条进行结果检测。注意增加阴性对照，避免假阳性；
12、请注意试纸条型试剂盒的扩增产物会被Nfo酶切割，不适合跑胶观察。
恒温扩增-Exo原理图：
Exo探针示例图：
